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包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢驗疑難析釋

發(fā)布時(shí)間：2019-09-04      瀏覽次數：12242    分享：

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種重要的水源性條件致病菌，廣泛存在于各類(lèi)型水中，對消毒劑、干燥、紫外線(xiàn)燈理化因素具有較強的抵抗力，可引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病。近年來(lái)，銅綠假單胞菌污染桶裝水的情況報道較多，是市面上包裝飲用水最容易出現的質(zhì)量問(wèn)題；2018年山東、江蘇、貴州、廣東等多省市瓶（桶）裝飲用水不合格率高發(fā)，主因是銅綠假單胞菌超標嚴重，該項目政府抽檢不合格率遠超其他抽檢項目，質(zhì)量安全問(wèn)題十分嚴重，主要原因是生產(chǎn)企業(yè)沒(méi)有做好日常生產(chǎn)過(guò)程的微生物監控，生產(chǎn)過(guò)程的消毒效果缺乏準確的驗證方法，使得生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量失控。

GB8538-2016食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法是國家最新公布的針對包裝飲用水銅綠假單胞菌的檢驗方法，檢驗程序如下：

標準的檢測過(guò)程寫(xiě)的比較精煉，對于一般生產(chǎn)企業(yè)的檢測人員來(lái)說(shuō)在實(shí)際的檢測過(guò)程中，會(huì )遇到比較多的問(wèn)題，以下來(lái)對其中的可能的檢測難點(diǎn)一一說(shuō)明并推薦相應的解決辦法。

操作步驟

1 水樣過(guò)濾

取好的水樣需在100級的潔凈工作臺用0.45um的濾膜進(jìn)行抽濾，將微生物截留在濾膜上，再將濾膜貼在CN瓊脂培養基上進(jìn)行培養，應避免在濾膜和培養基之間夾留氣泡。

這個(gè)步驟中有兩個(gè)方面檢測方法中未說(shuō)明，一是采用何種濾器和如何滅菌，二是濾膜如何滅菌。

包裝水生產(chǎn)企業(yè)可以購買(mǎi)專(zhuān)用的多聯(lián)不銹鋼過(guò)濾系統，一般材質(zhì)是不銹鋼的，可以用牛皮紙包好后直接放入滅菌鍋內進(jìn)行滅菌；也可以購買(mǎi)常見(jiàn)的砂芯過(guò)濾器，同樣可以用牛皮紙包好后放入滅菌鍋滅菌；如果需要使用的濾器數量較多，可以采用高溫火焰噴槍灼燒方式滅菌，也可起到滅菌效果。濾膜可采用一次性無(wú)菌濾膜。

多聯(lián)不銹鋼過(guò)濾系統

環(huán)凱多聯(lián)不銹鋼過(guò)濾系統

無(wú)菌濾膜

無(wú)菌微孔濾膜

2 濾膜在CN瓊脂培養和觀(guān)察

CN瓊脂培養后的菌落形態(tài)分以下三種，其它情況為非銅綠假單胞菌：

（1）藍色或綠色的典型可疑菌落，直接做綠膿菌素的確證性實(shí)驗，這個(gè)現象比較明顯，也容易辨認；

CN培養基上綠色菌落

綠膿菌素確證

（2）非藍綠色而在365nm紫外燈照射下產(chǎn)熒光的菌落，這種類(lèi)型的可疑菌落需進(jìn)行乙酰胺肉湯確證性實(shí)驗；

  

CN培養基上非藍綠色而在365nm紫外燈照射下產(chǎn)熒光的菌落

乙酰胺確證試驗

（3）是紅褐色菌落紫外燈照射下也不產(chǎn)熒光，需進(jìn)行氧化酶測試、乙酰胺液體培養基確證，金氏B培養基確證。

所有三種情況均需接種到營(yíng)養瓊脂培養基上進(jìn)行純化。

根據日常檢測數據的統計，前兩種的情況較多，第三種情況最少，而第二種即非藍/綠色的產(chǎn)熒光的菌落最具有迷惑性，也是檢驗的難點(diǎn)所在，需要特別仔細的進(jìn)行驗證。

典型菌落的形態(tài)周?chē)尸F融化的狀態(tài)，菌落數較少的情況下，劃線(xiàn)純化比較簡(jiǎn)單；菌落數較多的情況劃線(xiàn)就比較麻煩了，因為第一種典型可疑菌落是直接目測能看到的，而第二種情況產(chǎn)熒光是需要在360nm的紫外燈照射下才能看見(jiàn)是否產(chǎn)熒光，這就會(huì )可能導致劃線(xiàn)純化的時(shí)候可疑和典型菌落出現混淆錯劃的情況，會(huì )導致結果的截然不同。例如：挑取藍綠色可疑菌落純化時(shí)，因菌落溶解狀擴大，可能挑取時(shí)不僅挑取到了藍綠色可疑菌落，還挑取到其他類(lèi)型可疑菌落，純化后確證就可能導致結果完全改變的情況，解決辦法是在這種菌落較多的情況下，可以采取計數后分開(kāi)再在CN瓊脂平板上劃線(xiàn)一次，先在CN瓊脂平板上分離中上述幾種菌落的單個(gè)菌落，再劃線(xiàn)接種到營(yíng)養瓊脂平板上純化后進(jìn)行確證試驗，已避免因挑取典型菌落出現差錯導致結果的偏差。

3 確證性試驗

這里需特別注意的是上述的第二種情況，即非藍/綠色產(chǎn)熒光的可疑菌落的產(chǎn)氨實(shí)驗：

純培養物接種到乙酰胺液體培養基36℃培養20～24h后，滴加1～2滴鈉氏試劑，檢查產(chǎn)氨實(shí)驗，有出現從深黃色到磚紅色的顏色變化，則為陽(yáng)性，否則為陰性。

在實(shí)際過(guò)程中會(huì )發(fā)現確證試驗出現這種顏色變化過(guò)程的比例很高，是很多都是陽(yáng)性結果

經(jīng)過(guò)使用生化試劑條鑒定發(fā)現有近六成的比例并不是銅綠假單胞菌，是什么原因呢，主要是時(shí)間的問(wèn)題，時(shí)間比較久時(shí)，磚紅色出現的幾率比較高，會(huì )影響檢測人員的判斷，建議在3～5分鐘內進(jìn)行觀(guān)察，并且一定要與陽(yáng)性和陰性對照菌株進(jìn)行比較觀(guān)察，可有效降低誤判。另外推薦一種簡(jiǎn)單的方法：如覺(jué)得還有疑問(wèn)不能判定，可以從純培養物接種劃線(xiàn)到固體乙酰胺培養基進(jìn)行培養，銅綠假單胞菌在固體培養基上的特征是灰白色，扁平，邊緣不整齊，菌落周?chē)囵B基略帶粉紅色，可以結合固體和液體培養基的生長(cháng)特征和現象進(jìn)行判定，誤判基本可以消除，此方法成本很低，一般的生產(chǎn)企業(yè)可以使用。

銅綠假單胞菌的污染主要來(lái)自三個(gè)方面，一是水源的污染，二是加工過(guò)程的污染，三是包裝材料的污染，作為生產(chǎn)企業(yè)，需要通過(guò)提高自身的檢測能力，分別監測這三個(gè)方面的污染情況，采取有效的消毒滅菌方式，并驗證滅菌效果，可確保生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量安全有保障。

GB8538-2016銅綠假單胞菌檢驗操作過(guò)程中要考慮多種因素，實(shí)驗周期長(cháng)，對實(shí)驗人員專(zhuān)業(yè)水平要求高。下面給大家介紹一種操作簡(jiǎn)便、檢出率高的快檢方法——銅綠假單胞菌恒溫熒光核酸快速檢測試劑盒。

1 銅綠假單胞菌恒溫熒光核酸快速檢測方法

銅綠假單胞菌檢測試劑盒

與傳統檢測方法相比，省去繁瑣的可疑菌落逐步確證的工作，一步判讀結果，縮短結果報告時(shí)間，且實(shí)驗操作對檢驗人員工作經(jīng)驗要求不高！

2 環(huán)凱銅綠假單胞菌核酸檢測試劑盒組成

銅綠假單胞菌檢測試劑盒

3 銅綠假單胞菌快速檢測所需試劑、儀器及耗材列表

銅綠假單胞菌檢測試劑盒

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